4t1细胞用什么培养基

四川大学华西药学院Biomaterials：靶向自组装肽抑制乳腺癌进展和转移

DOI:10.1016/j.biomaterials.2020.120055

肿瘤细胞与周围微环境之间无处不在的相互作用促进了肿瘤的转移，因此中断这些交流对抗转移治疗具有巨大的潜力。在此，研究者描述了一种原位自组装策略，该策略限制了肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的直接接触。在这种策略中，Lys-Leu-Val-Phe-Phe肽基序通过透明质酸功能化的脂质体靶向肿瘤，并自发地自组装形成纳米纤维，其网状结构包裹在肿瘤细胞周围。纤维纳米结构掩盖了膜的突起，因此阻碍了肿瘤细胞的迁移和侵袭，特别是通过有孔内皮的迁移。肿瘤细胞上的纳米纤维涂层在体外显著限制了肿瘤细胞诱导的血小板聚集，并在体内阻止血小板在循环肿瘤细胞周围的粘附，从而限制了血小板的促转移作用并防止了早期转移。此外，纳米网稳定地保留在原发肿瘤部位72小时以上，并有效地阻止了肿瘤内血小板的激活，从而抑制了4T1乳腺癌小鼠模型中的肿瘤进展和自发性肺转移。该研究通过调节肿瘤细胞与TME之间的相互作用，为抗肿瘤转移铺平了道路。

图1.脂质体的表征。 通过DLS测定的脂质体的流体动力学尺寸分布和PDI。 通过DLS测定脂质体的表面ζ电位分布。通过TEM测定脂质体的形态。比例尺：100 nm。当与KF-Lipos共孵育时Th T的荧光发射光谱。脂质体中DPH的荧光各向异性。以不同的FITC/Cy3摩尔比记录的从490至650nm的FITC-HA/Cy3-Lipos的荧光发射光谱。用HAase处理的FITC-HA/Cy3-Lipos的荧光发射光谱。在37℃下通过FRET分析研究的FITC-HA/Cy3-Lipos的血清稳定性。通过浊度测量研究空白脂质体的稳定性。在37℃下以不同FITC/Cy3摩尔比的FITC-HA/Cy3-Lipos处理的4T1细胞的代表性CLSM图像。在静脉内施用FITC-HA/Cy3-Lipos后4小时从小鼠中获得的肿瘤组织的冷冻切片的代表性CLSM图像。

图2.癌细胞形态和细胞膜定位。用Lipos、HA-Lipos和KF-Lipos处理4小时并以未处理的4T1作为对照的4T1细胞的SEM图像。红色箭头，纤维状结构；白色箭头，颗粒结构。分别用DiD-Lipos、HA-DiD-Lipos和KF-DiD-Lipos孵育2 h的4T1细胞的CLSM图像，并进行定量分析。结合的示意图说明了KF-Lipos在癌细胞膜上的结构转化。

图3.乳腺癌细胞在3D环境中利用了增加的内皮通透性和肿瘤侵袭抑制能力。 3D Matrigel入侵检测。比例尺，100μm； 200μm。用于粘附测定的实验方案。 在对照缓冲液、游离Dox、Dox-Lipos、HA-Dox-Lipos和KF-Dox-Lipos处理后，具有代表性的荧光图像显示MDA-MB-231细胞在基质表面的利用性附着，并半定量测定肿瘤细胞的利用性附着程度。数据为平均值±SD，n=4。迁移测定的实验方案。代表性的荧光图像显示4T1细胞在暴露于对照培养基、游离Dox、Dox-Lipos、HA-Dox-Lipos和KF-Dox-Lipos的利用性迁移和半定量测定癌细胞的利用性迁移程度。数据为平均值±SD，n=4。

图4.KF-Dox-Lipos处理抑制了血小板的转移促进作用。（A）在对照缓冲液和Dox存在下与Plts-PKH26孵育的4T1-CFSE的代表性共聚焦图像。在培养基（II）、游离Dox（IV）、Dox-Lipos（V）、HA-Dox-Lipos（VI）和KF-Dox-Lipos（VII）存在下，以单独培养基（I）或添加到下腔室（III）中的血小板用作对照，与血小板孵育后的迁移（B）或侵入（C）4T1细胞的标准化数量（n=4）。（D）经内皮迁移试验的实验方案。（E）4T1细胞浸润内皮细胞单层的典型CLSM图像。（F）BALB/c小鼠肺中4T1-CFSE和Plts-PKH26的代表性共聚焦图像。（G）代表性的小鼠主要器官的体外生物发光图像。（H）在第15天采集的指定肺组织的H＆E染色。比例尺，3mm。

图5.药代动力学和生物分布检查。（A）Dox的体内药代动力学特征。数据代表平均值±标准偏差（n=5）。（B）在不同时间静脉注射游离DiD（I）、DiD-Lipos（II）、HA-DiD-Lipos（III）和KF-DiD-Lipos（IV）后的荷瘤小鼠体内荧光图像。（C）注射后72小时切除的肿瘤和主要组织的离体荧光图像。（D）肿瘤和主要组织的荧光强度的ROI分析。数据代表平均值±标准偏差（n=3）。（E）Dox治疗肿瘤的代表性CLSM图像。Dox，绿色；CD 31，红色；DAPI，蓝色。

图6.体内抗肿瘤和抗转移功效评价。（A）静脉注射不同Dox制剂后的肿瘤生长曲线。n=7。（B）在不同治疗组中携带4T1肿瘤的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。通过对数秩检验测定统计学显著性。（C）在第29天（上图）和第36天（下图）采集的小鼠肺组织的代表性图像。（D）通过H＆E染色对各组肺转移灶的组织学检查。比例尺，2毫米。（E）第36天，通过肉眼观察各组肺中转移结节的数目。与盐水组相比，＃p＜0.05。（F）各种样品对肺转移的抑制率（n=6）。（G）在第29和36天的肺转移的相对面积。p＜0.05，*与盐水对照相比显著。第29天，n=7；第36天，n=6。

图7.组织化学检查。（A）肿瘤切片的刚果红（红色）染色。（B）4T1肿瘤切片的TEM成像。红色箭头表示淀粉样纤维原位组装。（C）肿瘤组织中P-选择素（活化血小板的标记）的免疫组织化学测定。比例尺，2μm。（D）在肿瘤组织中的E-钙粘蛋白（上图）和MMP-9（下图）的免疫组织化学测定。比例尺，50μm。